河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）ELISA检测试剂盒说明书

一、概要：
         河豚毒素(Tetrodotoxin)是鲀鱼类（俗称河豚鱼）及其它生物体内含有的一种生物碱（氨基全氢喹唑啉型化合物），是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一；其毒性比剧毒的氰化钠还要高 1250 多倍，0.5mg 即可使人致命。
          本试剂盒是应用 ELISA 技术研发的河豚毒素药物残留检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点, 能最大限度地减少操作误差和工作强度。

二、实验原理：
         本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在酶标板微孔上预包被河豚毒素偶联抗原，样本中的残留物河豚毒素与微孔上预包被的偶联抗原竞争河豚毒素的抗体（抗试剂），加入酶标二抗（酶标物）后，经 TMB 底物显色，样本吸光度值与其所含河豚毒素的含量呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中的河豚毒素含量。

三、适用范围：
         可定性、定量检测肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢（雄性为精束）等部分的河豚毒素残留量。

四、 交叉反应率：
         河豚毒素……………………………………………100%

五、使用单位需自备的设备及试剂
        设备：
       ┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
       ┅┅涡旋仪
       ┅┅恒温培养箱（室温能达到25℃可不选）
       ┅┅天平：感量0.01g
       ┅┅离心机
       ┅┅刻度移液管：10mL
       ┅┅洗耳球
       ┅┅聚苯乙烯离心管：50mL
       ┅┅微量移液器：单道 10μL～100μL、100μL～1000μL
                               多道 30μL~300μL
       设备：
       ┅┅去离子水
       ┅┅冰醋酸
       ┅┅氯化钠

六、 提供的材料与试剂

注：
       1、标准品浓度分别为 0 ppb, 2ppb,6ppb,18ppb,54ppb,162ppb。
       2、样本稀释液：如检测样本中河豚毒素的含量超出试剂盒可检测的最大值（324ppb）,可用样本稀释液进行适当稀释后再进行检测，样本最终含量值需乘以对应的稀释倍数，稀释后的样本含量值应在标准曲线浓度（0-162ppb）范围内。

七、溶液的配制
       配液 1: 洗涤工作液 用去离子水将浓缩洗涤液(10×)按 1:9 体积比进行稀释，即：1 份浓缩洗涤液(10×)加 9 份去离子水；用于酶标板 的洗涤，洗涤工作液在 2-8℃环境可保存一个月。
       配液 2: 样本提取液 取 1 mL 冰醋酸加入到 999 mL 去离子水中并充分混匀，然后再称取 50 克氯化钠加入其中并充分混匀使氯化钠完全溶解（2-8℃环境可保存一个月）。

八、 样本前处理步骤
       （a） 实验中必须使用一次性枪头，在吸取不同的试剂时要更换枪头。
       （b） 实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
       （c） 未处理的样本冷冻保存。
       （d） 处理后的样本可在 2~8℃避光保存 24h。
样本前处理方法：
       河豚鱼冷冻样品，装于密封塑料袋中于流水下急速解冻，整体鱼用蒸馏水清洗后，用滤纸吸干，然后将鱼分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢（雄性为精束）等部分，用蒸馏水洗去血污，再用滤纸吸干，分别将解剖后取得的样品剪碎，充分均质。
       ----称取上述均质样品 2.0 g ± 0.02g 于 50 mL 聚苯乙烯离心管中，加入 4mL 样本提取液（配液 2），充分涡流混合 3-5min；
       ----于 4000r/min，离心 10min，取上清液 50μL 分析；稀释倍数：2

九、检测步骤
       1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
       2、 取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入锡箔袋，保存于 2～8℃。
       3、 洗涤工作液在使用前也需回温。
       4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
       5、 加标准品/样本/酶标物/抗试剂：加标准品/样本 50μL/孔到对应的微孔中，再加入河豚毒素酶标物 50μL/孔，然后再加入河豚毒素抗试剂 50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25℃避光环境中反应 30min。
       6、 洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤 4~5 次，每次间隔 10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
       7、 显色：加入底物液 A 液 50μL/孔，再加底物液 B 液 50μL/ 孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25℃避光环境中反应 15min。
       8、 测定：加入终止液 50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630nm 检测，请在 5min 内读完数据），测定每孔 OD 值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。

十、结果判定
       结果判定有两种方法，定性判定可用第 1 种方法，而定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与其所含河豚毒素呈负相关。
       1、 定性分析
       用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本 1 的吸光度值为 0.569，样本 2 的吸光度值为1.725，标准品吸光度值分别是：0ppb 为 2.523；2ppb 为 2.217；6ppb 为 1.566；18ppb 为 1.142；54ppb 为 0.687；162ppb 为 0.345。则样本 1 的浓度范围是 54ppb～162ppb；样本 2 的浓度范围是2ppb～6ppb，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中河豚毒素的浓度范围。
       2、 定量分析
       （1） 百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0 标准）的吸光度值，再乘以 100%，即 B 百分吸光率（%）＝        ×100% B₀
B—标准品或样本溶液的平均吸光度值
B₀—0(ppb)标准品的平均吸光度值
       （2） 标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以河豚毒素标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中河豚毒素的实际残留量。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

十一、试剂盒参数
       试剂盒灵敏度：2ppb 样本最低检测限：组织…………………………………………………………4ppb 回收率：
       织……………………………………………………100±20% 精密度：试剂盒的变异系数小

十二、注意事项
       1、 室温低于 20℃或试剂及样本没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。
       2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
       3、 每加一种试剂前需将其摇匀。
       4、 反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。
       5、 不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
       6、 储存条件： 保存试剂盒于 2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进锡箔袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
       7、 试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0 标准的吸光度（450/630nm）值小于 0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。
       8、 在加入底物液 A 液和底物液 B 液后，一般显色时间为 15min 即可。若颜色较浅，可延长反应时间到 20min。但不得超过 20min，反之，则减短反应时间。
       9、 该试剂盒最佳反应温度为 25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

十三、贮藏条件及有效期
       贮藏条件：保存试剂盒于 2~8℃。
       有效期：该产品有效期为 12 个月。