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非洲猪瘟病毒直扩荧光 PCR 检测试剂盒说明书
兽药名称
通用名称:非洲猪瘟病毒直扩荧光 PCR 检测试剂盒
商品名称:无
英文名称:Direct Amplification PCR Kit for detection of ASFV
汉语拼音:Feizhouzhuwen Zhikuo Yingguang PCR Jianceshijihe
【主要成分】本试剂盒由样品前处理液、PCR 反应液、阴性对照、阳性对照和说明书组成。
【作用与用途】用于猪全血、血清、脾脏等样品中 ASFV DNA 的检测。
【用法与判定】
1. 样本处理
液体类样本:如血清、研磨上清、细胞培养液、拭子浸泡液等可以直接用来进行 PCR 反应,不需要前期处理。(注:若样本混有杂质或溶血严重,需 12000rpm 离心 2min,上清作为 PCR 模板)。
血液类样本:取血浆或全血(新鲜抗凝全血)20μl 加入到 100μl 样品前处理液中,震荡混匀后,100℃加热 5 分钟,10000rpm 离心 1min。取 2.5μl 上清液作为 PCR 模板用(必须现处理现用)。
★ 注意:对于全血样品,加热之后需立即离心,否则影响分离效果,影响结果的准确性。
组织等固体类样本:取少量样品(约 20mg,一颗大米大小)于 1.5ml 的离心管中,加入 100μl 生理盐水,用组织研磨器充分研磨。研磨结束后,取 20μl 加入到 100μl 样品前处理液中,震荡混匀后,100℃加热 5 分钟,10000rpm 离心 1min。取 2.5μl 上清液作为 PCR 模板用(必须现处理现用)。
2. 扩增试剂配制
试剂组分 | 扩增试剂配制方法 |
PCR反应液 | 22.5μl |
模板 | 2.5μl |
3. 反应程序设定
按照下表进行 PCR 仪程序设定;选择 FAM 通道(Reporter:FAM)检测;具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
1 | 95 ℃ | 2 min | 1 cycle |
2 | 95 ℃ | 7 sec | 3 cycles |
60 ℃ | 12 sec | ||
3 | 95 ℃ | 6 sec | 40 cycles |
58℃(此步收集荧光) | 11 sec |
注:1. 若使用ABI荧光定量PCR仪,不选ROX校正,淬灭基团选None。
2. 若使用 ABI7500 荧光定量 PCR 仪等采集荧光时间不低于 30sec 等仪器,58℃收
集荧光时间更改为 30sec。
4. 结果判定
分析条件设置:阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。
如果阳性对照扩增曲线有明显对数扩增曲线,且 Ct 值≤30,阴性对照无明显扩增曲线,二者均成立才可判定试验成立,否则试验无效。
Ct参考值 | 参考值判定说明 |
Ct值≤35 | ASFV核酸检测阳性 |
35<Ct值≤37 | ASFV核酸检测可疑,需重新对样本进行检测。若重复 检测该样本Ct值≤37,则判为ASFV核酸检测阳性 |
Ct值>37或者无数值 | ASFV核酸检测阴性 |