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T-2毒素酶联免疫测试盒说明书
说明
本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定谷物中玉米赤霉烯酮。该测试盒反应孔可拆卸,可测单份样品,也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。
1 概要
T-2毒素(T-2 toxin)主要是由镰孢属的拟枝孢镰孢(F. sporotrichioides)等产生的有毒代谢产物,属单端孢霉烯族化合物A型,对人畜具有较大的危害。该毒素是体内蛋白质合成的抑制剂,人畜误食后,可引起呕吐、腹泻、发热等急性中毒症状,严重时可损伤造血组织、造成死亡。因此对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁。
目前检测粮食和饲料中T-2毒素的仪器方法有液相色谱、气相色谱、质谱和毛细管电泳法等,这些方法灵敏度较高,结果稳定,但所需仪器设备昂贵,样品准备耗时长,不适于大量样品的筛选。本试剂盒是以应用单克隆抗体为基础的ELISA检测方法,可以准确快速检测粮谷类中的T-2毒素。
2 测定原理
本测试盒用固相酶联免疫吸附原理,利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板,加入T-2毒素标准品或样品、抗T-2毒素单克隆抗体进行免疫反应后,将未与包被抗原结合的抗体洗去;再加入酶标记的抗鼠IgG的抗体孵育,加入底物显色,终止液终止后,用酶标仪在450nm处测定OD值。
3 提供的物品
微孔板
5个浓度的T-2标准溶液(各1mL)
标准1:0ng/mL ……………………………………………………………直接使用
标准2:100.0ng/mL ………………………………………………………直接使用
标准3:200.0ng/mL ………………………………………………………直接使用
标准4:500.0ng/mL ………………………………………………………直接使用
标准5:1000.0ng/mL ………………………………………………………直接使用
T-2单克隆抗体溶液(6mL) ………………………………………………………直接使用
酶标物(12mL) ………………………………………………………………………直接使用
显色液(12mL) ………………………………………………………………………直接使用
终止液(6mL) …………………………………………………………………………直接使用
浓缩洗液(30mL) ……………………………………………………………………稀释使用
空白对照(6mL) ………………………………………………………………………直接使用
4 盒中未提供,需自备物品
微孔板酶标仪(含450nm)、振荡器、粉碎机、微量移液器
量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸
氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、去离子水或蒸馏水
5 操作者注意事项
----标准溶液中含有T-2毒素,应特别小心。
----终止液为1N硫酸,避免接触皮肤。
----每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。
----每步加样时间应控制在5min内。
----孵育过程中应避光。
----不要使用过期试剂盒。
----不要交叉使用不同批号的试剂盒中的试剂
6 储存条件
----保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻
----显色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。
----将不用的微孔板放进原铝箔袋中,置2-8℃保存。
7 试剂变质的标志
----标准1的吸光度值小于0.5个单位(A450nm <0.5)时,表示试剂可能变质。
8 样品处理
----样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存;
----取5g粉碎的有代表性的样品,加1.25g氯化钠及25mL 70%甲醇溶液;
----强力振荡3分钟;
----用快速定性滤纸过滤;
----取1mL滤液,用1mL去离子水或蒸馏水稀释
----取50μL稀释液进行分析。
----*根据需要可以增加样品量,但甲醇溶液的量也应相应增加。
9 酶标免疫分析程序
----浓缩洗液为10倍浓缩液,使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。
----取所需数量的板条插入微孔架,记录样品及标准的位置。
----加入50mL标准品或处理好的样品到微孔,每个标准和样品必须使用新的吸头。
----加入50mL抗T-2单克隆抗体使用液到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到孔中的液体,避免交叉污染)中,37℃孵育90min。
----甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
----每孔加入酶标物100mL,37℃孵育60min。
----用洗液洗涤微孔板3min×3次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
----每孔加入显色液100mL(2滴),37℃孵育10min。
----每孔加入终止液50mL(1滴),立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值(OD值)。
10 样品浓度计算
以标准溶液OD值与标准1OD值的比值为纵坐标,所对应标准溶液浓度(ng/mL)的对数值为横坐标,制作标准曲线。根据样品OD值与标准1OD的比值,可从曲线上得到对应点的横坐标,即为T-2毒素浓度的对数值,求得反对数即为测定液中T-2毒素浓度C(ng/mL),按下列公式计算出样品中T-2毒素含量:
T-2毒素含量(mg/kg)= C×K
式中:C:稀释后样品提取液中T-2毒素含量(ng/mL)
K:样品稀释倍数(本提取方法为50)
11试剂盒主要技术指标及参数
测试盒最低检出浓度100.0ng/mL,回率70%-120%,交叉反应系数小于1%,试剂盒校正曲线的线性范围100.0ng/mL -1000.0ng/mL,试剂盒条内变异<10%,条间变异<15%。
附图(仅供参考)
T-2毒素浓度对数值 (ng/mL)