玉米赤霉烯酮（ZEN）定量酶联免疫检测试剂盒说明书

说明
      本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定谷物中玉米赤霉烯酮。该测试盒反应孔可拆卸，可测单份样品，也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。
1 概要
       玉米赤霉烯酮是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的真菌毒素，主要污染玉米、小麦、大麦等谷物，可引起动物（猪最敏感）和人的雌激素过多综合征，还具有生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性等，严重威胁人体健康。
      目前检测粮食和饲料中ZEN的仪器方法有薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法和质谱法等，这些方法有的灵敏度较高，结果稳定，但所需仪器设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的筛选。本试剂盒是以应用单克隆抗体为基础的ELISA检测方法，可以准确快速检测玉米中的ZEN。

2 测定原理
      本试剂盒用固相酶联免疫吸附原理，利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板，加入ZEN标准品或样品、ZEN单克隆抗体进行孵育后，将未与包被抗原结合的抗体洗去；再加入酶标记的抗鼠IgG抗体（酶标物）孵育，加入显色液显色，经终止液终止后，用酶标仪在450nm处测定OD值。 3 提供的物品 微孔板
5个浓度的OA标准溶液（各1mL）
      标准1：0ng/mL ………………………………………………………………直接使用
      标准2：2.0ng/mL ……………………………………………………………直接使用
      标准3：5.0ng/mL ……………………………………………………………直接使用
      标准4：10.0ng/mL …………………………………………………………直接使用
      标准5：20.0ng/mL …………………………………………………………直接使用
ZEN单克隆抗体溶液(6mL) ………………………………………………………直接使用
酶标物(12mL) ………………………………………………………………………直接使用
显色液(12mL) ………………………………………………………………………直接使用
终止液(6mL) …………………………………………………………………………直接使用
浓缩洗液(30mL) ……………………………………………………………………稀释使用
空白对照(6mL) ………………………………………………………………………直接使用
4 盒中未提供，需自备物品
      微孔板酶标仪（含450nm）、振荡器、粉碎机、微量移液器
      量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸
      氯化钠（分析纯）、甲醇（分析纯）、去离子水或蒸馏水
5 操作者注意事项
----标准溶液中含有ZEN毒素，应特别小心。
----终止液为1N硫酸，避免接触皮肤。
----每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。
----每步加样时间应控制在5min内。
----孵育过程中应避光。
----不要使用过期试剂盒。
----不要交叉使用不同批号的试剂盒中的试剂
6 储存条件
----保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻
----显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
----将不用的微孔板放进原铝箔袋中，置2-8℃保存。
7 试剂变质的标志
----标准1的吸光度值小于0.5个单位（A450nm <0.5）时，表示试剂可能变质。
8 样品处理
----样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存；
----取5g粉碎的有代表性的样品，加1.25g氯化钠及25mL 70%甲醇溶液；
----强力振荡3分钟；
----用快速定性滤纸过滤；
----取1mL滤液，用1mL去离子水或蒸馏水稀释
----取50μL稀释液进行分析。
----*根据需要可以增加样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加。
9 酶标免疫分析程序
----浓缩洗液为10倍浓缩液，使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。
----取所需数量的板条插入微孔架，记录样品及标准的位置。
----加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，每个标准和样品必须使用新的吸头。
----加入50mL抗ZEN单克隆抗体使用液到每个微孔（注意移液器管尖不要接触到孔中的液体，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。
----甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
----每孔加入酶标物100mL，37℃孵育60min。
----用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
----每孔加入显色液100mL（2滴），37℃孵育10min。
----每孔加入终止液50mL（1滴），立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值（OD值）。
10 样品浓度计算
      以标准溶液OD值与标准1OD值的比值为纵坐标，所对应标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，制作标准曲线。根据样品OD值与标准1OD的比值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为ZEN浓度的对数值，求得反对数即为测定液中ZEN浓度C（ng/mL），按下列公式计算出样品中ZEN含量： ZEN含量（mg/kg）= C×K
式中：C：测定液中ZEN浓度（ng/mL）
K：样品稀释倍数（本提取方法为50） 11试剂盒主要技术指标及参数
      测试盒最低检出浓度2.0ng/mL，回收率70%-120%，交叉反应系数小于1%，试剂盒校正曲线的线性范围2.0ng/mL -20.0ng/mL，试剂盒条内变异＜10%，条间变异＜15%。
附图（仅供参考） ZEN校正曲线    浓度对数值（ng/mL）