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本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定谷物中AFB1。该测试盒反应孔可拆卸,可测单份样品,也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。
1 概要
黄曲霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物,主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉毒素以AFB1为主,AFB1属于强烈致癌物质,肝脏是其主要的靶器官,具有极强的急性毒性和致癌性。
AFB1检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和ELISA方法,本试剂盒是以应用单克隆抗体为基础的ELISA检测方法,可以准确快速检测粮谷类和花生及饲料中的AFB1。
2 测定原理
本试剂盒采用固相酶联免疫吸附原理,利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板,加入AFB1标准品或样品、抗AFB1单克隆抗体进行孵育后,将未与包被抗原结合的抗体洗去;再加入酶标记的抗鼠IgG抗体孵育,加入显色液,经过终止液终止后,用酶标仪在450nm处测定OD值。
3 提供的物品
----微孔板…………………………………………………………… 包被有AFB1-BSA
----5个浓度的AFB1标准溶液(各0.5mL)
标准1:0ng/mL…………………………………………………………………………………直接使用
标准2:0.1ng/m…………………………………………………………………………………直接使用
标准3:0.2ng/mL ……………………………………………………………………………直接使用
标准4:0.5ng/m………………………………………………………………………………直接使用
标准5:1.0ng/m………………………………………….……………………………………直接使用
----抗AF B1单克隆抗体溶液(6mL)………………………………………………………直接使用
----酶标物(12mL)..……………………………………………………………………………直接使用
----显色液(12mL)..……………………………………………………………………………直接使用
----终止液(6mL)………………………………………………………………………………直接使用
----浓缩洗液(30mL)..…………………………………………………………………………稀释使用
4 盒中未提供,需自备物品
----微孔板酶标仪(可于450nm处测定)、振荡器、粉碎机、微量移液器
----量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸
----氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、去离子水或蒸馏水
5 操作者注意事项
----标准溶液中含有黄曲霉毒素,应特别小心。
----使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用pH7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡过夜。
----终止液含有硫酸,避免接触皮肤。
----每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。
----每步加样时间应控制在5min内。
----孵育过程中应避光。
----不要使用过期试剂盒。
----不要交叉使用不同批号的试剂盒中的试剂。
6 储存条件
----保存试剂盒于2~8℃。不要冷冻。
----显色液对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。
----将不用的微孔板放进原铝箔袋中,置2~8℃保存。
7 试剂变质的标志
----标准1的吸光度值小于0.5个单位(A450nm<0.5)时,表示试剂可能变质。
8 样品处理
----样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存。
----取5g粉碎的有代表性的样品,加1.25g氯化钠及25mL70%甲醇-水溶液。
----强力振荡3分钟。
----用快速定性滤纸过滤。
----取1mL滤液,加水4mL进行稀释。
----取50μL稀释液进行分析。
----*根据需要可以增减样品量,但甲醇-水溶液的量也应相应增减。
9 酶免疫分析程序
----浓缩洗液为10倍浓缩液,使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。
----取所需数量的板条插入微孔架,用洗液洗涤微孔板3min×2次。
----加入50mL标准品或处理好的样品到微孔,记录样品及标准的位置,每个标准和样品必须使用新的吸头。
----加入50mL抗体溶液到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到孔中的液体,避免交叉污染)中,37℃孵育90min。
----甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
----每孔加入酶标物100mL,37℃孵育60min。
----用洗液洗涤微孔板3min×5次,最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
----每孔加入显色液100mL(2滴),37℃孵育10~12min。
----每孔加入终止液50mL(1滴),立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值(OD值)。
注:在定量分析中,显色液和终止液需要用移液器准确量取。
10 样品浓度计算
以标准溶液OD值与标准1OD值的比值为纵坐标,所对应标准溶液浓度(ng/mL)的对数值为横坐标,制作标准曲线。根据样品OD值与标准1OD的比值,可从曲线上得到对应点的横坐标,即为AFB1浓度的对数值,求得反对数即为测定液中AFB1浓度C(ng/mL),按下列公式计算出样品中AFB1含量:
AFB1含量(mg/kg)= C×K
式中:C:稀释后样品提取液中AFB1含量(ng/mL)
K:样品稀释倍数(按照本说明书中样品处理程序方法为25)
11试剂盒主要技术指标及参数
测试盒最低检出浓度0.1ng/mL,回收率70%~120%,与AFB2的交叉反应系数小于1%,与AFG1的交叉反应系数为4.65%,与AFG2交叉反应系数小于1%。试剂盒校正曲线的线性范围0.1~1.0ng/mL,试剂盒条内变异<10%,条间变异<15%。
附图(仅供参考)
AFB1毒素浓度对数(ng/mL)
(一)流行病学特点
霉变谷物中毒可发生在任何季节,中毒发生主要在南方高温高湿地区,如广东、广西、福建等省,以玉米为主食的地区较易发生此类中毒。
(二)临床表现和预后
1.黄曲霉毒素引起的急性中毒临床特点是有短时间、一过性的发热、呕吐、厌食、黄疸,有些症状较轻的病人可以恢复,重症病人在2~3周内出现腹水、下肢浮肿、肝和脾肿大,很快死亡。
2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇引起的急性中毒临床表现与赤霉病麦中毒相同(见“赤霉病麦中毒”).预后良好。
(三)诊断依据
1.黄曲霉毒素中毒的病人有肯定的近期进食发霉的主食(玉米、大米等)的历史,食后除有一般消化系统症状外,还有黄疸、腹水、肝、睥肿大等体征。实验室检查病人吃剩的主食可有发霉变质现象,且每千克样品中可测出毫克数量计的黄曲霉毒素.从病人血液或尿中可测出黄曲霉毒素M1。
2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇引起的急性中毒病人有肯定的近期进食发霉变质玉米等谷物的历史。食后有恶心、呕吐、头晕、头痛、腹泻、腹痛等一般消化系统和神经系统症状。病程短,预后良好。可采取病人吃剩的玉米等食品,检测其中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
具体诊断依据行业标准WS/T11—1996《霉变谷物中呕吐毒素食物中毒诊断标准及处理原则》。
(四)治疗原则
1.黄曲霉毒素食物中毒
(1)停止食用霉变食物。并立即给予催吐、洗胃和导泻。
(2)急性轻度中毒可门诊或住院观察,对症治疗。
(3)急性重度中毒病人需住院治疗,按急性中毒性肝炎的方案治疗。
2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇食物中毒
(1)立即停止食用霉变食品。
(2)轻度中毒病人无需治疗,1~2天内即可痊愈。重症病人对症治疗。
(五)预防与控制
1.黄曲霉毒素食物中毒
(1)收获后的粮食要及时晒干,使粮食中水分降低到安全水分以下。
(2)挑除霉粒 可使粮食中黄曲霉毒素大大降低,玉米、花生等可用此法。
(3)碾轧加工 可用于受毒素污染的大米,精度越高,去毒效果越好;
(4)加水搓洗 淘洗大米时,用手搓洗,随水倾去悬浮物.反复搓洗5~6次,可除去大部分毒素。
(5)脱胚去毒 将玉米磨成3~4mm的碎粒,加清水浸泡,每天换水3~4次,连续泡3天,可使玉米中黄曲霉毒素由200~670ug/kg降低到0。处理后的玉米可制成淀粉。
(6)花生油、玉米油等食用植物油可加碱去毒后再用白陶土吸附处理。可使毒素的含量大大降低。
(7)加强粮食及油料作物中黄曲霉毒素的监测。
2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇中毒
(1)加强谷物在田间和贮藏期的防霉措施。
1)选用抗赤霉病的品种。
2)降低田间水位,做好开沟排水。
3)使用高效、低毒和低残留杀菌剂。
4)及时脱粒、晾晒,降低谷物水分含量至安全水分。
5)贮存的粮食要勤翻晒,注意通风.防治病菌继续繁殖产毒。
(2)加强粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的监测。